說說人表皮永生化細胞HACAT的培養(yǎng)步驟。

　　1、復蘇細胞：在37℃水浴中快速搖動裝有1mL細胞懸液的冷凍管融化，加入5mL培養(yǎng)基并充分混合。在1000RPM下離心5分鐘，棄去上清液，加入4-6mL*培養(yǎng)基并充分吹掃。然后將所有細胞懸浮液添加到培養(yǎng)瓶中，并培養(yǎng)過夜（或將細胞懸浮液添加到6cm皿中）并培養(yǎng)過夜。第二天換培養(yǎng)基，檢查細胞密度。

　　2、細胞傳代：如果細胞密度達到80％-90％，則可以傳代培養(yǎng)。
 

　　對于貼壁人表皮永生化細胞HACAT ，傳代可參考以下方法：

　　（1）棄去培養(yǎng)上清液，并用不含鈣和鎂離子的PBS沖洗細胞1-2次。

　　（2）向培養(yǎng)瓶中加入1-2ml消化液（0.25％胰蛋白酶-0.53mMEDTA），將其置于37℃的培養(yǎng)箱中1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞的消化情況，如果大部分細胞旋轉并掉落后，迅速將其帶回手術臺，輕敲培養(yǎng)瓶幾次，并加入5ml以上含10％血清的*培養(yǎng)基終止消化。

　　（3）輕輕吹干細胞，然后將其*吸出。以1000RPM離心8-10分鐘，棄去上清液，加入1-2mL培養(yǎng)基并充分吹掃。

　　（4）加入5-6ml/瓶培養(yǎng)液，然后將細胞懸液分成新的培養(yǎng)皿或瓶，其中裝有5-6ml培養(yǎng)液的比例為1：2至1：5。

　　對于懸浮人表皮永生化細胞HACAT，傳代可參考以下方法：

　　（1）收集細胞，以1000RPM離心8-10分鐘，棄去上清液，并加入1-2mL培養(yǎng)基吹凈，然后將細胞懸液分成新的培養(yǎng)皿或瓶，其中含有8ml培養(yǎng)基，比例為1：2至1：5。

　　（2）可以選擇一半的介質更換方法。丟棄一半培養(yǎng)基后，懸浮剩余的細胞，然后將細胞懸浮液分成新的含有8ml培養(yǎng)基的細胞懸浮液，比例為1：2至1：3。在盤子或瓶子里。

　　3、細胞凍存：當細胞生長良好時，可以將其冷凍保存。將貼壁細胞冷凍保存后，棄去培養(yǎng)基并加入少量胰蛋白酶。細胞變成圓形并脫落后，通過離心收集它們。